ATCC原代細胞的制備流程主要包括組織塊培養(yǎng)法和分離細胞培養(yǎng)法。以下是這兩種方法的具體步驟:
1.組織塊培養(yǎng)法
準備組織材料:將取得的組織材料用培養(yǎng)液濕潤,并使用鋒利的眼科剪去除脂肪和結(jié)締組織,然后用平衡液(PBS或Hanks液)漂洗多次,直至液體清亮。
剪切組織塊:使用眼科彎剪將組織塊剪成小塊,并用PBS或Hanks液再次漂洗。
放置組織塊:用吸管吸取切碎的組織塊,輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中,均勻分布,注意不要使組織塊與培養(yǎng)液接觸。
培養(yǎng)組織塊:將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn),使瓶底朝上,在種植了組織塊一側(cè)的對側(cè)面加足培養(yǎng)液,塞緊瓶塞后靜置于37℃培養(yǎng)箱中。
更換培養(yǎng)液:每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液,或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。
2.分離細胞培養(yǎng)法
消化組織:首先用細胞分散法收獲細胞,隨時吸取少量消化液在鏡下觀察,并根據(jù)組織是否分散成細胞團或單個細胞,采取終止消化措施。
制備細胞懸液:低速離心細胞懸液,棄掉上清液,加入含血清的培養(yǎng)液,輕輕吹打制成細胞懸液,計數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度。
接種細胞:根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型和實驗要求,用吸管吸取一定量的細胞懸液,加到培養(yǎng)瓶中,對于需要特殊底物的細胞,要先將底物涂一層于培養(yǎng)瓶皿底壁,然后接種細胞。
培養(yǎng)細胞:將培養(yǎng)瓶放入37℃恒溫箱中培養(yǎng),每隔2到3天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時間。